按照實驗方法的不同可將致瘤實驗分為體外致瘤試驗和體內致瘤試驗兩種，為保證實驗的準確性， hUCMSC注射液的致瘤性分析一般需要體內、體外實驗同時進行，相互驗證。造血干細胞存儲

(一)體外致瘤試驗：采用軟瓊脂克隆形成試驗法

1.設計原則及方案，體外致瘤性是指將待檢細胞接種到軟瓊脂上進行長期培養，連續3周觀察接種的細胞是否能在軟瓊脂上形成桑葚狀的克隆團，以此來間接證實該細胞是否具有腫瘤細胞致瘤的特性。

2.操作方法

(1)陽性對照的制備：取狀態良好的對數生長期的Hela細胞，消化后用含胎牛血清的RPM640/MEM完全培養液制備成一定濃度的細胞懸液備用。

(2)陰性對照的制備：制作方法同上，只是細胞換成MRC-5細胞。造血干細胞存儲

(3) hUCMSC的準備：用含胎牛血清的DMEM/F12完全培養基調整 hUCMSC成一定濃度備用。

(4)軟瓊脂的制備：分為底層瓊脂制備和上層瓊脂制備。先用蒸餾水分別配制兩個不同濃度的低熔點瓊脂糖液，高壓滅菌后，置于40℃溫水中而保持不凝固，然后等體積將高濃度瓊脂糖和含2倍胎牛血清的 DMEM/F12培養基混勻，取2ml混勻的瓊脂培養液加入6板的每孔中，不能有氣泡，室溫靜置凝固備用。分別將低濃度瓊脂培養液與制備好備用的細胞等體積混勻，均勻地鋪在有底層瓊脂的6孔板中,1m/孔，靜置后鏡下觀察細胞分布是否均勻。將培養板置37℃5%CO2培養箱中培養。每周1次鏡下觀察是否有克隆形成，并且拍照記錄，連續觀察3周至陽性對照生長出明顯克隆為準。造血干細胞存儲

3.判定標準及注意事項一般腫瘤細胞經過1-3周的培養在上層瓊脂內可見桑葚狀克隆團形成，鏡下觀察可見克隆內的細胞呈透亮的圓形團狀。一般認為由16個細胞以上組成的細胞團為一個克隆，克隆團內的細胞數目隨著培養時間延長而增多。如果見細胞成顆粒狀且輪廓不清楚，說明細胞已死亡。如連續3周仍未見克隆團形成，則考慮接種的細胞沒有腫瘤特征，間接反應該細胞的移植后無致瘤性。