【造血干細胞存儲】臍帶間充質干細胞的分化潛能鑒定——成胰島細胞誘導

2023-12-26 14:52:51

次

1.取體外傳代培養(yǎng)至第3代的人臍帶間充質干細胞，用6孔細胞培養(yǎng)板和完全培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，帶細胞生長密度達到70%時開始進行誘導培養(yǎng)，設3個復孔，同時設對照孔。

2.管吸岀培養(yǎng)液，加亼復方電解質衡液3ml，造血干細胞存儲輕輕晃動使死細胞及細胞碎片漂浮，然后吸除上清液,反復2次。

3.加入誘導培養(yǎng)基3ml，培養(yǎng)體系為：高糖DMEM基礎培養(yǎng)基、10%胎牛血清、10ngbFGF、1 umol/β-巰基乙醇。

4.誘導培養(yǎng)7天。

5.更換為含10%胎牛血清、20 ng/ml bFGF、20 ng/L EGF，lμ mol/mlB-巰基乙醇、造血干細胞存儲10 umol/ml尼克酰胺的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6~7天。

6. insulin和C肽表達分析將誘導好的細胞用4%多聚甲醛固定10分鐘→加入3%H2O2→靜置5分鐘→PBS沖洗5分鐘×3次→在標記好的孔中分別加入鼠抗人 insulin和C肽抗體→4℃過夜→PBS沖洗5分鐘×3次→滴加熒光二抗→37℃孵育20分鐘→用PBS洗滌5分鐘×3次→光鏡下觀察并排照記錄。

7.特異性基因Pdx/1、造血干細胞存儲 NeuroD1、Ng/3轉錄分析設計、合成引物，購買反轉錄PCR試劑盒，提取總RNA，按試劑盒操作說明書的操作程序進行實驗，將RNA反轉錄為cDNA以cDNA為模板進行PCR反應，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。

8.誘導培養(yǎng)過程中每2天1次在倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察細胞生長和形態(tài)變化并拍照記錄(圖6-9)

造血干細胞存儲