1.主要試劑

(1)臍帶間質干細胞成軟骨誘導分化培養基：臍帶間質干細胞成軟骨誘導分化基礎培養基175ml、抗壞血酸60ul、mS添加物2ml、TGF-β32ml丙酮酸鈉200μ、脯氨酸200ul。造血干細胞存儲

(2)其他：阿新藍染液、15m離心管、PBS、中性甲醛。

2.步驟

(1)當培養的臍帶間充質干細胞融合度達到80%~90%時，胰酶消化收集。

(2)對消化后的細胞計數，將計數后的細胞轉移到15ml離心管中。

(3)調整為75×10°lsml的密度重懸間質干細胞，室溫下150g離心5分鐘，吸去上清。

(4)用成軟骨誘導完全培養基按照50×105clml的密度進行重懸。

(5)吸取0.5ml(2.5×10cll)細胞懸液轉移到15ml離心管中，室溫下150g離心5分鐘。造血干細胞存儲此步驟不需要吸掉上清并重懸細胞。

(6)擰松離心管蓋以便于氣體交換，將其放置于37℃,5%CO2的培養箱中培養。24小時內不要搖動離心管。

(7)每隔2~3天需要給細胞換用新鮮的成軟骨誘導分化完全培養基(為防止軟骨球在換液時被吸出，建議在吸管前段加上一個1~200ul的槍頭)，每管0.5ml。

換液之后，輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。擰松離心管蓋放入37℃,5%CO2培養箱中培養。

(8)誘導培養14~28天。對軟骨小球進行甲醛溶液固定和石蠟包埋，進行阿新藍染色并拍照。

3.結果分析臍帶間充質干細胞經成軟骨誘導分化后，分化形成的軟骨膠原基質被阿甲新藍染成藍色(圖6-7)。

事實上，不斷深入的基礎研究證實： UCMSO在體內特定的組織微環境或體外特定的誘導培養條件下，可以跨胚層分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，這種強大的分化潛能使其成為組織工程再造的最佳候選者。雖然按照國際細胞治療協會提出的“間充質干細胞的標準”，確定細胞可以誘導向脂肪、造血干細胞存儲骨和軟骨細胞分化，就可以鑒定是 UCMSC了，但這只能說明其具有多向分化能力，沒有體現其跨胚層分化能力，因此建議在此基礎上增加向神經、胰島等多胚層組織細胞分化潛能分析。