超高速離心法(差速離心法)

超高速離心法是目前文獻上報道較多，被大多數研究者采用的分離方法，據調查，約有56%的文獻中采用超高速離心法分離外泌體。具體操作步驟如下：

①收集培養上清。對于臍帶間充質干細胞，采用無血清培養體系培養細胞48小時后收集培養上清,4℃保存待用(1周以內)或者-80℃長期保存備用。之所以采用無血清培養體系，造血干細胞存儲是因為血清中含有外源外泌體，會帶來外源外泌體的污染，直接影響后續分析的結果。

②300×g，4℃，離心10分鐘，保留上清。此步驟的目的是去除培養上清中的細胞。

③2000×g,4℃，離心10分鐘，保留上清。此步驟的目的是去除上2000×g,10分鐘清中的死細胞。

④10000×g,4℃，離心30分鐘，保留上清。此步驟的目的是去除上清中的細胞碎片。

⑤100000g,4℃,離心70分鐘，保留沉淀。此步驟所得沉淀是外泌體和可溶性蛋白的混合物。

⑥加入預冷的PBS，洗滌沉淀,10000×g,4℃，離心70分鐘，保留沉淀。此步驟所得沉淀即為較純的外泌體。

對于超高速離心法收集外泌體，造血干細胞存儲有以下幾個關鍵點需要注意：

①所有離心的步驟都需要在4℃完成。

②除非所收集的外泌體需要用于功能實驗(體內實驗或者體外實驗)，否則對于離心管不做無菌要求。但收集外泌體的離心管需要和離心機配套且潔凈。

③如果收集的外泌體需要做無菌保存，用作相應的功能實驗。對于離心所用的離心管、轉頭和轉子都需要用70%的乙醇徹底消毒，離心管還需要進一步用無菌的PBS沖洗2次，并傾倒干凈。

下面對超高速離心法的各步驟詳細闡述：

1.去除條件培養基中的細胞死細胞和細胞碎片

(1)將條件培養基(通常是無血清培養48小時后的細胞培養上清)轉移到50ml離心管中。

(2)2000×g,4℃,離心20分鐘。

(3)小心吸出上清，轉移到超高速離心機對應的專用離心管中(確保所吸取的上清中不含有任何沉淀。造血干細胞存儲在獲取上清時盡量使用吸管吸出的方式，而不是傾倒的方式來收取上清，吸取上清時距離沉淀上表面保留約0.5cm時停止吸取，避免吸入沉淀)。

(4)超高速離心之前用記號筆在超高速離心管的一側做好標記，離心時將作有標記的一側朝外,10000×g,4℃，離心30分鐘(做標記的目的是為了在離心結束的時候確定沉淀的位置)。

2.收集外泌體

(1)將上清轉移到新的離心管或者離心瓶中(和第3步中的離心管或者離心瓶型號致)。此步要確保轉移上清的時候不要混入沉淀。本步中所得到的沉淀肉眼不可見，需要根據上一步記號筆標記的位置來確定。對于變角轉頭，沉淀在離心管底部；對于固定角轉頭，造血干細胞存儲沉淀在記號筆標記的朝外一側。轉移上清的過程中，手持離心管并保持在一定的角度，保證沉淀始終被上清覆蓋的狀態，當液面高度僅為05cm時即可停止轉移上清。

(2)離心:10000×g,4℃，至少70分鐘。此步為超高速離心，因此所有的離心管中液體體積至少為總體積的四分之三；如果某一管體積不夠，可用預冷的PBS補齊。離心的時間以轉速達到10000×g開始計算，值得注意的是，超高速離心機啟動后到達10000大約需要10分鐘，而時間設定上限不超過3小時，時間長短并不會破壞外泌體的結構，只會影響提取的純度和產量。

(3)棄盡上清：對于固定角轉頭，此步用傾倒的方式優于吸管吸取的方式；而對于變角轉頭，去除上清時需要注意不要完全去除，保留約2m的上清更佳。

3.洗滌外泌體

(1)用1ml預冷PBS重懸上一步所獲得的沉淀，用移液槍進行吹打。將來源相同的重懸液合并到同一個離心管中，然后加入PBS直到充滿離心管。此步所獲得的沉淀同樣不可見。

(2)10000×g,4℃,1小時。注意“1小時”指的也是轉速達到1000009g時的保持時間。

(3)盡可能去除上清：對于固定轉頭，傾倒上清時保持管口朝下，并用移液槍講管壁上懸掛的液體吸掉。然后根據需要進行11或11b所述步驟。

(4)重懸沉淀(即外泌體)：加入小體積(50-100u)PBS或者TBS重懸沉淀。造血干細胞存儲如果此步所獲得的外泌體懸液的總體積過大(大于原始條件培養基的1200積時)或者在上一步看不見沉淀，可用步驟11b替代此步。

(5)濃縮外泌體：將步驟10所得上清離心,10000×g,4℃,1小時，用TLA-100.3的轉頭和對應的超離管。去上清，觀察沉淀，加入20~50u新鮮配置的PBS重懸沉淀(即外泌體)。

(6)外泌體的保存：-80℃保存體積為100u的外泌體懸液保存時間可達1年。注意避免反復凍融。

注意：對于某些細胞(例如：小鼠的DC細胞)，可用0,2m過濾的方式替代上述方法中的步驟(1)至(6)，達到除去細胞、死細胞和細胞碎片的目的。