條件培養基的準備

收集含有外泌體的條件培養基是外泌體分離工作的基礎，而此處所描述的條件培養基的準備工作對于所有的分離方法都適用。在準備條件培養基的同時，應該收集細胞的全裂解液用作后續分析工作的對照。西安干細胞存儲

(一)條件培養基的收集和處理

1.細胞準備，選擇生長狀態良好且無污染的臍帶間充質干細胞(代數越低其分泌能力越好)鋪板，完全培養基培養備用。如果采用超高速離心法分離外泌體，通常需要準備至少70ml的條件培養基方夠后續分析鑒定工作的開展。因此，推薦采用15cm培養皿或者T175的培養瓶進行細胞培養。

2.更換培養基，當細胞覆蓋率達到70%-80%時，去除完全培養基，PBS洗3次，盡棄上清，更換為無血清培養基(不含有FBS)，此步可以選擇商品化的間充質干細胞專用的無血清培養基(含有血清替代物，西安干細胞存儲可以保持干細胞的生長)也可以采用DMEM/F12基礎培養基。

3.細胞培養，在無血清培養體系中繼續培養干細胞。對于商品化的無血清培養基，可以根據其相應的說明，調整上述兩步。以B公司生產的無血清培養基為例，可以從細胞傳代開始就采用無血清培養體系培養細胞，原則是讓后收集到的條件培養基不含有外源的外泌體成分。

4.收集培養，上清對于培養體系商品化無血清培養體系，由于其培養體系中不含有任何外源外泌體成分，因此可以根據細胞狀態收集干細胞培養上清，西安干細胞存儲通常是在細胞長滿時收集。而對于不含有FBS的基礎培養基，從換上空白培養基開始繼續培養細胞48小時后收集培養上清。

5.條件培養基的預處理，用巴士滴管或者吸管(無菌)將條件培養基收集到無菌的50ml離心管中,300×g,4℃，離心10分鐘，保留上清。

6.條件培養基的保存，4℃存放可以保存1周，-80℃存放可以保存幾個月。但建議將培養基保存在4℃,1周內進行分離提取。因為-80℃保存容易導致外泌體形態上的變化，不利于后續鑒定工作，尤其是電鏡鑒定工作的開展。

(二)準備全細胞裂解液

全細胞裂解液用于后續外泌體分析工作(主要是免疫沉淀實驗)的對照，具體實驗方法如下：

1.收集細胞，胰酶消化1~2盤/瓶上述用于收集條件培養基的臍帶間充質干細胞，終止后計數。

2.離心，將(1~5)×107個臍帶間充質干細胞收集到15ml離心管中，西安干細胞存儲去上清后用適量PBS重懸細胞，再次300×g,4℃，離心5分鐘。去上清，保留沉淀。

3.加入200u(對應1×107細胞數)細胞裂解液，冰上裂解20分鐘，在起始和結束裂解時渦旋振蕩。

4.收集細胞裂解液,20000×g,4℃，離心20分鐘，保留上清。-20℃或-80℃凍存。