繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)的細(xì)胞可用完全培養(yǎng)基稀釋后接種于新培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，用于儲(chǔ)存的 UCMSC需添加凍存液后保存?zhèn)溆谩榫S持細(xì)胞的活性，長(zhǎng)期低溫凍存 UCMSC時(shí)，凍存液需要在完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加保護(hù)劑。常用的細(xì)胞滲透保護(hù)劑有甘油、二甲基亞砜(DMS0)、甲醇、乙二醇、丙二醇、乙酰胺等，滲透性冷凍保護(hù)劑可在細(xì)胞懸液凍結(jié)凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，維持凍存過(guò)程中的細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)平衡，保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，使細(xì)胞內(nèi)的水分不會(huì)過(guò)分外滲，從而使細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓基本一致。西安臍帶干細(xì)胞存儲(chǔ)本實(shí)驗(yàn)室使用的間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液是在完全培養(yǎng)基( DMEMF12培養(yǎng)基、25%胎牛血清、SCF50ngml、FGF50ng/ml、bFGF50ng/ml)的基礎(chǔ)上添加2%人血白蛋白、10%二甲基亞砜作為細(xì)胞保護(hù)劑，方法是用該凍存液將細(xì)胞稀釋成5×10°細(xì)胞/ml的密度，分裝于凍存管中，貼上標(biāo)簽，置于程序降溫儀中，漸進(jìn)降溫，最終于-196℃的液氮中長(zhǎng)期凍存。用于臨床治疔的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可用含2%人血白蛋白的復(fù)方電解質(zhì)平衡液1ml稀釋，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度和活細(xì)胞比例后，繼續(xù)稀釋成(1~3)×10°細(xì)胞/m，分裝于專用塑料輸血袋中，標(biāo)簽注明細(xì)胞類型、數(shù)量、體積、密度、批號(hào)、制備人等基本信息，傳遞出實(shí)驗(yàn)室備用。 UCMSC凍存操作步驟如下:

(1)向離心洗滌后的 UCMSC加入凍存液，輕輕震蕩或吹打使細(xì)胞混勻，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量及計(jì)算密度。

(2)用凍存液稀釋成5×10°個(gè)細(xì)胞/ml。

(3)將細(xì)胞懸液分裝于2ml體積的專用凍存管內(nèi)，細(xì)胞懸液的分裝體積按凍存管容量的2乃3計(jì)量，不宜加滿，以免膨脹爆裂，然后擰緊瓶蓋，貼上標(biāo)簽，標(biāo)明細(xì)胞名稱、代數(shù)、密度批號(hào)、制備人、制備日期等信息。

(4)遵循“慢凍快融”的原則，將裝有(1~3)×10°細(xì)胞/ml的凍存管置于程序降溫系統(tǒng)中，降溫速度1-2℃/min，當(dāng)溫度低于-25℃后，降溫速度可加快至5-10℃/min，當(dāng)溫度下降至低于-80℃后，西安臍帶干細(xì)胞存儲(chǔ)直接進(jìn)入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。程序降溫系統(tǒng)是在液氮凍存灌的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)安裝了自動(dòng)降溫控制系統(tǒng)，按操作要求放置凍存管后即可自動(dòng)降溫。

(5)對(duì)于沒(méi)有自動(dòng)降溫控制系統(tǒng)的 UCMSC凍存，可將凍存管放入普通冰箱的4℃冷藏室中靜置30分鐘，然后轉(zhuǎn)移到冷凍室(-10-20℃)中放置1-2小時(shí)，再轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱(-70~80℃)中放置過(guò)夜，最后將凍存管放入液氮中保存。如果沒(méi)有超低溫冰箱的話，可將冷凍室(-10-20℃)中放置后的凍存管置于液氮罐的液氮上方的入口附近過(guò)夜后再置于液氮中。

UCMSC可在-70-80℃條件下儲(chǔ)存3-6個(gè)月無(wú)明顯活性下降，但長(zhǎng)期儲(chǔ)存必須置于液氮中。凍存劑中的DMsO不能防止細(xì)胞內(nèi)的水分結(jié)冰，因此需要一定時(shí)間的預(yù)冷，使其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡，以起到充分的保護(hù)作用。配制DMSO時(shí)，應(yīng)使用臨床級(jí)DMSO，西安臍帶干細(xì)胞存儲(chǔ)采用過(guò)濾法除菌，不能采用高壓滅菌法，因?yàn)镈MSO本身具有一定的殺菌作用，高壓滅菌會(huì)破壞其分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致冷凍保護(hù)效果降低。DMSO在低溫條件能夠保護(hù)細(xì)胞并且毒性較低，但在常溫條件下則對(duì)細(xì)胞有一定毒性作用，操作中應(yīng)注意戴手套防護(hù)。在凍存UCMSC的過(guò)程中，特別是人站在液氮儲(chǔ)存系統(tǒng)附近操作時(shí)應(yīng)戴手套、眼鏡、穿工作服，動(dòng)作要輕，小心液氮濺出造成凍傷。