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臍帶間充質干細胞的生長特性及表型特點-西安脂肪細胞庫

2021-12-30 14:02:23

UCMSC在消化制備的細胞懸液中呈圓形,接種于培養瓶中一般在24小時左右開始貼壁,西安脂肪細胞庫貼壁生長初期呈梭形、多邊形或多角形,隨著細胞增殖和數量增加,逐漸變成成纖維細胞樣梭形,達到80%~90%融合時基本呈長梭形。原代培養的 UCMSC中并非全部都是均一細胞,可能含有少量的多個核、小圓形細胞和成纖維細胞。采用組織塊培養法分離 UCMSC,般在7天左右有零星細胞爬出,在第10天左右(8-14)會有大量細胞從組織塊中爬出,初期沿組織塊周圍呈出芽式向外生長,細胞呈短梭形,逐漸伸出長足,繼續培養5-7天時呈放射狀生長,根據接種組織塊的密度不同,達到80%細胞融合的原代培養時間在2~3周。

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傳代培養的 UCMSC一般在24小時左右開始貼壁生長,初期呈圓形、多邊或多角形,貼壁后的潛伏生長期為3~5天,指數增殖期為4~7天,細胞呈克隆式、放射狀、火焰狀或螺旋狀生長,隨著細胞數量不斷增多,生長空間逐漸減少,細胞相互匯合成片,達到90%細胞融合的時間為5~7天,細胞形態基本呈長梭形成纖維細胞樣。細胞倍增時間為30小時,指數增殖期后應再次收集細胞和進行傳代培養,否則細胞進入生長平臺期,西安脂肪細胞庫即細胞生長至相互接觸后會抑制細胞運動,再加之細胞生長空間限制,細胞處于生長停止期,雖然細胞生長速度減慢,但代謝活動仍然繼續,如果繼續培養則可能因為營養不足、代謝產物積累、pH值下降等導致細胞中毒,出現細胞形態改變,細胞收縮、脫落、漂浮和死亡。隨著 UCMSC傳代培養次數的增加,雜細胞逐漸被稀釋,比例逐漸減小,第3~5代的 UCMSC基本形態均一, UCMSC純度達到9%。指數增殖期,人臍帶MSC在體外培養體系中能快速增殖,傳代后3-5天能增殖4~5倍,傳代培養10代以上細胞可增加510倍,且增殖速度無明顯降低,傳代穩定。細胞周期分析表明,C0~G1期和G2M期所占比例分別為78.84%11.16%。

流式細胞儀分析證明MSC細胞表達CD44、CD105,整合素受體CD29CD51及間質干細胞受體SH2、SH3,但不表達造血系標志CD34CD35。增殖特性:RT-PCR檢測結果顯示,UCMSCOct4mRNA表達陽性,而Oet4是胚胎干細胞特異性基因,對胚胎干細胞的建系及維持干細胞未分化狀態具有重要意義。因為西安脂肪細胞庫 UCMSO既表達MSC的細胞表面標志,又表達胚胎干細胞的部分標志,它們之間既有聯系又有差異,因此可能既非胚胎干細胞又非成體干細胞,而是處于兩者之間的一類新的多能干細胞。根據國際細胞療法間充質與組織干細胞R(the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy)2006年提出的低標準,MSC需滿足以下條件:①MSC在標準培養條件下呈貼壁生長;②MSC表達CD05、CD73CD90,不表達CD45、CD34、CD14CD1lbCD79aCD19HLA-DR③MSC在體外至少能向成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞分化。西安脂肪細胞庫和其他來源的MSC一樣, hUCMSC呈長條梭形貼壁生長,表達CD73CD90CD105CD166、CD10CD13CD29、CD44HLA-ABC,不表達CD34CD45、CD31等造血干細胞標記或CD33、CD4、CD56HLA-DR、HLA-DA、HLA-DPHLA-DQ,體外誘導培養能向多種成體細胞分化。

比照這些條件,華爾通膠來源的間質細胞具有MSC特性, UCMSC的培養、鑒定也應至少滿足上述低標準。 hUCMSC還表達原始干細胞標記,如白血病抑制因子受體通路胚胎干細胞特異基因及端粒反轉錄酶及 NanogSTAT3AP、Oct4、BMP4、PAX6、ADAM12NestinHLA-I, hUCMSC低表達移植相關的細胞表面標記CD80、CD86、CD40CD4OL等。在混合淋巴細胞檢測中呈免疫抑制,西安脂肪細胞庫并抑制T細胞的增殖,異體移植該細胞可產生免疫耐受性,表明其為一類免疫缺陷細胞,異基因移植不會發生免疫排斥反應。總之,在 UCMSC的鑒定方面, UCMSC應從形態特征、生長特性、表型標志、分化潛能、分泌功能、免疫調節能力及療效等方面建立系統、全面的評價技術和標準。


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