干細胞的體外培養特性，與一些成熟細胞相比，干細胞的體外培養條件要求相對苛刻，因為它在體外培養條件下容易自然分化而失去干細胞的基本特性。西安白血病干細胞干細胞的體外培養難點是既要維持干細胞的“干性”，又要令其增殖而保持未分化狀態，這本身就是一對矛盾。由于不同來源的干細胞，其生長特性差異較大，體外培養條件也有一定差別，一般需要根據不同類型的干細胞建立相應的個性化培養體系，特別是將某種干細胞建成細胞系，更需要建立穩定的培養技術。體外制備干細胞包括干細胞或富含干細胞的材料采集、分離純化、擴增、鑒定及儲存等過程，分離、培養過程需要在無菌層流實驗室中進行，需要在培養體系中添加一些維持其“干性”和促進增殖的因子。

胚胎干細胞的體外分離培養原始材料來源包括受精卵發育而來的桑葚胚、囊胚內細胞團、胎兒生殖脊等。體外制備包括以下過程：①原始胚胎干細胞的獲取：采用機械法分離、胰酶或膠原酶消化獲得原始胚胎干細胞懸液。②細胞傳代培養：將細胞懸液接種在改良的 Eargle培養液中培養2~3天，然后轉移到經放射線照射或絲裂霉素處理的成纖維細胞飼養層上進行傳代培養。由于處理后的成纖維細胞失去了增殖能力，但還能分泌多種細胞因子，可維持胚胎干細胞的“干性”和促進其增殖。飼養層細胞一般采用3T3、STO等小鼠細胞系，也可采用自制的胎鼠成纖維細胞。培養體系中，一般還需要添加適當濃度的胎牛血清(FBS)非必需氨基酸、β-巰基乙醇、白血病抑制因子(LF)干細胞因子(SCF)堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等，其中LF具有抑制胚胎干細胞分化的功能。為防止細菌污染可按其他細胞培養體系的要求加入雙抗。胚胎干細胞在培養體系中呈克隆生長，待單個細胞長成集落后，挑取細胞集落，用低濃度的胰酶消化分散后，繼續用上述培養體系進行傳代培養。西安白血病干細胞經反復傳代培養，可獲得高純度的生長旺盛的胚胎干細胞。如果撤除培養體系中的血清成分，胚胎干細胞會自動分化形成擬胚胎體，其中含有多種類型的組織細胞，說明血清中可能含有維持胚胎干細胞特性的因子。③細胞鑒定：對細胞的生長特性、表型標志、核型、細胞周期、分化潛能進行分析鑒定。④胚胎細胞儲存：將胚胎干細胞置于含有10%二甲基亞砜(MDoS)的胚胎干細胞培養液中，按常規方法程序降溫，置于-196℃液氮中長期保存。近些年還開發出一些無血清的干細胞培養基，實驗證實干細胞在這些培養基中生長良好，避免了添加血清中攜帶病原的可能性，減少了胚胎干細胞在體內研究與應用中的干擾因素，為臨床應用奠定了基礎。基因導入或小分子化合物等誘導培養獲得的胚胎干細胞樣細胞，其培養、擴增條件與胚胎干細胞相似。優化胚胎干細胞的培養條件，研究更為高效的培養基，特別是不含血清的培養基仍然是胚胎干細胞研究的重要方面。

成體干細胞的種類繁多，幾乎在所有組織中均發現有干細胞存在，不同組織來源的干細胞在數量、細胞形態、生長特性、表型標志、分化條件及分化潛能上千差萬別，體外培養條件要求不盡一致，很難建立一套適用于所有成體干細胞培養的通用技術方案，需要針對不同類型的成體干細胞建立“個性化”體外制備技術。由于成體干細胞可以來源于自體，避免了免疫排斥和胚胎干細胞涉及的倫理及安全問題，在臨床上具有優先應用優勢，因此在2000年以來受到高度重視，在體外制備技術方面取得了諸多突破性成果，極大地促進了成體干細胞技術產業的發展和轉化應用。成體干細胞體外制備通常也包括材料采集、分離純化、體外擴增、誘導分化、儲存、復蘇等關鍵技術環節。西安白血病干細胞在采集獲得成體組織之后，根據組織來源及特性，分別采用機械分離、密度梯度離心、酶消化、免疫磁珠分離、流式細胞術分離等方法分離制備成單細胞懸液，然后將其置于特定的培養體系中進行原代和傳代培養，培養體系中一般也要加入維持“干性”和促進其生長的細胞因子，例如干細胞因子(SCF)堿性成

纖維細胞生長因子(bFGF)等。為進一步純化干細胞，在培養過程中根據干細胞的特性進行貼壁培養、差速貼壁、克隆篩選、免疫吸附等辦法進一步純化和去除雜細胞，例如利用間充質干細胞貼壁生長的特性進行貼壁培養可獲得骨髓、脂肪、臍帶等組織中的間充質干細胞，采用差速貼壁法可去處其中的少量成纖維細胞。有一些成體干細胞可采用組織塊培養法獲得，方法是將組織剪碎成小于1mm³大小的組織塊，將其接種于培養瓶底，先加入少量培養液，待組織塊貼壁后再補充培養液繼續培養，其中的干細胞可沿組織塊周圍長出，然后去除組織塊并進行傳代擴增獲得大量干細胞。這種方法適用于臍帶間充質干細胞等貼壁生長較快的干細胞，同一組織塊可進行反復培養。骨髓、臍血組織中的造血干細胞一般采用流式細胞術、免疫磁珠法可分離獲得純度大于99%的造血干細胞，但體外擴增相對困難，一般要在半固體培養基上進行擴增，培養基中需要添加血清、多種促進其生長的因子。也有人認為，在干細胞培養體系中添加血小板生長因子可促進干細胞生長，甚至可以取代血清添加。還有一些干細胞在體外培養體系中適于懸浮生長并形成懸浮細胞球，例如海馬神經干細胞、視網膜神經干細胞等。西安白血病干細胞總之，成體干細胞的分離主要利用其生長特性進行選擇性培養或依據相對特異的標志性細胞表面抗原進行免疫學篩選，體外擴增則需要根據其生長特性建立不同的培養體系和技術方法，培養體系中需要添加促進生長和維持“干性”的細胞因子，否則傳代培養后，干細胞會自動分化和老化而失去活性。